清洁是指去除灰尘、污垢和有机污渍。清洁方法包括刷、吸、干擦、洗涤或用浸泡肥皂水或清洁剂的湿布拖擦。粉尘、污物以及有机物是微生物的栖身之所，并可能影响除污染剂（抗菌剂、化学杀菌剂以及消毒剂）的作用。
二氧化碳培养箱必须先经过清洁才能实现消毒和灭菌的目的，许多杀菌剂只对经过清洁过的物品才具有杀菌活性。清洁时必须使用与以后使用的消毒剂或杀菌剂化学性质上相容的试剂进行清洁、消毒。
1、清洁箱体表面：先拂去表面的灰尘，再用湿的海绵或软布清洗，再用软布擦干。如果有污物则用低浓度的清洁剂清洗，然后擦干。
2、清洗箱体内部：选择合适的消毒剂。所有的物件和表面必须彻底清洗，然后用无菌水冲洗，再擦干或晾干。
3、清洗玻璃门：清洗箱内的玻璃门时使用的清洁剂和清洗培养箱内部时使用的相同。然后用蒸馏水漂洗，从而清除残留的清洁剂，然后用软布把门擦干。
消毒是指杀死微生物的物理或化学手段，但不一定杀死其孢子。灭菌是指杀死所有微生物，当二氧化碳培养箱内细胞受到污染时则需要采取灭菌措施。
一般，在二氧化碳培养箱内细胞没有污染的情况下平均1-3个月彻底消毒一次。常用的3种消毒灭菌的方式是：液体消毒剂、紫外和干热。
1、液体消毒剂：选择对二氧化碳培养箱无腐蚀性的液体消毒剂，并且液体消毒剂的消毒效果好坏和很多因素有关。比如：场所的温度、接触时间、pH、穿透能力、有机物的反应。
这些因素中的一些很小的变化可能会造成去污剂的效力上大的不同。因此甚至在很有利的情况下，当最终要求必须无菌时，液体去污剂也不是完全可信赖的去污方法。
2、紫外消毒：一般先用蒸馏水清洗干净后，再用培养箱自带的紫外灯照射一天。当紫外灯在有遮光罩的情况下照射时，紫外线照射到腔体的次数很少。
3、干热灭菌：当CO2培养箱用于污染危险区域时，干热灭菌可作为清洁室内的附加手段。干热灭菌采用6面直接加热，加热温度高达125°C。这使得腔体能够破坏细菌。高温（125°C）在培养箱中保持2小时以上。
经过8小时的灭菌程序（包括2-3小时的预热时间，具体情况取决于温度），灭菌室内的温度降低并恢复到37°C或上一个程序设定的温度。
除了以上几种方法外，还可以采用联合杀菌的方法，几种消毒灭菌的方法同时使用来达到彻底清洁的效果。
